DEAE Sephrose CL-6B使用说明

DEAE Sepharose CL-6B是一种弱用离子交换剂，有非常好的流动性质和很高的容纳所有PI值蛋白质的能力，离子交换群体是二乙氨乙基，它可以保持带电状态并在整个工作范围PH3-9维持持续的高容量。

Tablel 表1 胶性质

离子交换剂类型：弱阴离子

总离子容量：0.13~0.17m mole/m¹胶

有效容量：甲状腺球蛋白（TG） MW669.000    2mg/ml

          HSA     MW  68000      170 mg/ml

          2-乳清蛋白质   MW  14  300   150 mg/ml

颗粒结构：67交联   agarose

颗粒尺寸范围：45~165um

平均粒子尺寸：90um

最大流速：150 cm/h

最大操作压力：0.015Mpa(0.15bar,2psi)

PH稳定性：长期  3~12

           短期  2~10

化学稳定性：通常用水溶液buffer,1.0氨基酸，1.0NaoH,8M VREA尿素；8M的盐酸胍，乙醇，丙醇等。

物理稳定性：由于PH或离子强度变化引起的体积变化可以忽略

高压灭菌：在0.1M  Nacl   121℃     30min

有效容量是由在0.5×5cm柱子，线性流速为300cm/h条件下确定的，使用的初始buffer为0.05M  Tris  PH8.3，洗脱buffer包含2M Nacl.

给定的范围是由我们的知识和经验估计的，请注意如下几个方面：（1）pH稳定性，长期的参考的pH区间是指在以后的层析过程中胶体保持稳定，长时间内不会受到页面的影响。（2）pH稳定性，短期参考的pH区间指，再生和CIP和灭菌过程。

胶作准备：

DEAE，Sepharose CL-6B应先在20%乙醇中预膨胀，倾析掉20%乙醇制备粗纯物，取代之为初始指buffer,按75%的沉积胶25%的buffer的比例，初始buffer中不应含有明显增加粘度的试剂。装柱完成以后应用粘性buffer在减小的流速下平衡。

装柱：Sepharose  CL-6B gols

1．  在层析进行过程吕所在温度下，平衡所有材料

2．  除去粗纯物中气泡

3．  除去柱子颗粒体空间内的气体，利用buffer流动，确保柱子网状结构中没有气泡残留，关掉柱子开关，并在柱子中保留几厘米buffer .

4．  将粗纯物的连续加入柱子中，用玻璃棒斜靠柱壁，将粗纯说沿玻璃棒加入以减少气泡的导入。

5．  立即用buffer填满柱子，盖上顶端连上泵。

6．  打开柱子底部开关，让泵在所需流速下进行，流速至少应控制在层析过程所需流速的135%倍然而最大流速（参考表1）。主要适用于装柱过程，不要超过表1所给出最大流速，Note:如果在最大流速下装柱在接下来的层析过程中不要超过比数值的75%。

7．  当达到一个柱床高度以后，保持此流速流过三个床体积。

Vos  of  adaptor  受体使用

受体按下列条件加入：

1．  按上述说明装好柱子以后，关掉底部开关，去掉顶部盖子，小心用buffer加满柱子剩余空间，以使在顶部形成一个向上的弯液面。

2．  将受体，与柱子成一角度加入，保证在下面网孔中没有气泡。

3．  连接好所有管子连接，必须保证从柱子到泵的管子和从柱子到样品应用系统中没有气泡。

4．  慢慢向下滑动柱塞，以保证网状结构和毛细管中气泡被洗脱剂取代赶走。在过程中，应旋转柱子开关的阀门向各个方向旋转以确保气泡被赶完全。

5．  在此条件下锁住受体，打开柱子开关，开始洗脱，按装柱流速让洗脱液流过直到胶床稳定。若需要重新在胶体表面加入受体。

平衡：

开始实验之前，确保离子交换床已达到平衡，通过泵入初始buffer通过柱子，直到洗脱液的导电率和pH值与进入溶液相同。

●结合：最普遍的过程是：让目的物分子结合到离子交换剂上而且其它分子流过，然而，在一些情况下，结合其它的“感染剂”而让目的分子流过更有用，

●     吸附过程中，选择一个最适pH值buffer非常关键，请参考表2，buffer的离子强度应保持很低不至于干挠样品的结合，推荐的pH值，应在buffer的Pka值上下偏差0.5个pH单位范围内，并至少高于目的分子的pI值1个pH单位。

洗脱：解吸附/解离应在递增盐梯度（线性或阶梯性）或递减pH梯度条件下进行。

再生：根据样品的性质，再生通常用一个高离子强度的buffer冲洗耳恭听，（例如1-2M Nacl）或渐小的PH，然后用初始的buffer再平衡。

在有些条件下，有此物质请如变性Pr或脂质，不能再生过程中洗脱，这些物质可以在CIP过程中除去。

CIP

用0.5柱体积2M  Nacl溶液冲洗柱子除去结合pr，接触时间为10-15min，后流筒。

除去预期pr，亲水性结合pr和脂质蛋白，用1M  NaoH 在大约40cm/h的线性流速下冲洗柱子，接触时间1-2br，后流向。

除去强结合的亲水性结合pr，脂pr脂质用4个柱体积的70%乙酸或30%异丙醇冲流柱子后流向，当使用有机溶剂时应用递增梯度洗脱以避免气泡形成。

同样也可用2个样体积清洁的碱或酸性溶液冲洗柱子，例如，使用0.1-0.5%的非离子型清洁剂溶于0.1M氨基酸中，用大约40cm/h的线性流速冲洗，然后用5个柱体积70%的乙醇，冲洗柱子以除去残留的清洁剂。

在所有条件下，应使用至少3个柱体积的初始buffer.

Sanifation:

Sanifation过程以将微生物污染减至最小

用0.5~1M  NaoH 在40cm/h的流速下冲洗柱子，接触时间30~10min，反流相3~5倍柱体积无菌初始buffer重新平衡。

在柱子上述CIP或灭菌过程中不会有明显改变

保存：

建议长期储存胶在20%乙醇中4℃。