Ni-NTA  Sepharose 的使用方法                             

下列方法适用于从细菌中抽提通常含有6个氨基酸尾（His-6）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质。其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-6结构，提供的层析方法可供参考。

Ni²⁺亲和柱的制备

1．  轻轻颠倒混匀固化Ni²⁺树脂，取2ml装入层析柱，树脂自然沉降。

2．  用3倍柱体积的无菌水冲洗树脂。（树脂自然沉降后为1个柱体积）

3．  用3倍柱体积的结合缓冲液（pH7.8）平衡树脂，放置待第9步使用。

制备细胞抽提物

4．  准备细胞，接种，诱导表达，在细胞OD600＝0.5-0.8时，用1mmol/LIPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率，收集细胞。每100ml细胞培养物的细胞沉淀，悬于4ml结合缓冲液（pH7.8）.

5．  加入溶菌酶至终浓度１mg/ml,冰上放置30min，超声或匀浆破碎细胞。

6．  混合物于4℃摇床上孵育10min。

7．  加入Triton X-100 、DNase和RNase,终浓度分别为１％、5ug/ml和5ug/ml,再于４℃摇床上孵育10min。

8．  4℃3000g(5000r/min Sorvall SS-34转头)离心30min,去掉不溶性细胞碎片，上清（细胞裂解液）转移到另一个新管中。

纯化带组氨酸标签蛋白

９．树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部。

10．步骤8获得的上清上柱，流速调整为每小时10个柱体积。

11．用6个柱体积的结合缓冲液（pH7.8）洗柱。

12．用4个柱体积的洗涤缓冲液（pH6.0）洗柱，直到流过液A₂₈₀＜0.01。

13．用6个柱体积的10mmol/L咪唑洗脱液洗脱结合的蛋白，每份1ml分步收集，监测A₂₈₀。

14．用咪唑浓度更高（50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L）的洗脱液重复步骤13。

15．用20ul等份的蛋白进行SDS-PAGE，分析蛋白分布。

试剂配方

1．结合缓冲液：（pH7.8）

20mmol/L磷酸钠

500mmol/L氯化钠

2．咪唑洗脱缓冲液：（pH6.0）

20mmol/L磷酸钠

500mmol/L氯化钠

在洗涤缓冲液中加入咪唑分别配成10mmol/L、50mmol/L、100mmol/L和150mmol/L的咪唑洗脱缓冲液。

3．洗涤缓冲液：

20mmol/L磷酸钠

500mmol/L氯化钠