DNA合成常见问题及分析
1.引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆ C18 柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对 DNA 有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通 PCR 反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆ OPC 纯化： OPC 纯化是根据 DNA 保护基（ DMTr 基）和 Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的 DNA 片段。 OPC 法纯化的 DNA 纯度大于 95% 。适用于 40mer 以下引物的纯化。
◆ PAGE 纯： PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的 DNA 的方法。 PAGE 纯化法也是一种非常有效的 DNA 纯化方法，纯化后的 DNA 纯度大于 95% ，对长链 Oligo DNA ( 大于 50mer) 的纯化特别有效。
◆ HPLC 纯化： HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理，对 DNA 片段进行纯化。纯度可以大于 99% 。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。本公司现在 OPC 与 PAGE 两种纯化方式供你选择。
2.引物的 OD 数如何定量？
答：引物合成引物 OD 数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长 260nm ，石英比色杯，光程为 1 厘米 ，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0 之间。 DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用 1ml 水稀释测 OD 值。需要根据稀释倍数换算出母液的 OD 值。
3.投诉定量不准是怎么回事儿？
答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有：
（1）生产人员定量错误。这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户 OD 数，因为无论 OD 数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到 OD 数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。一般情况下，引物都有留样。接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。
（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。
（3）系统误差，我们认为 10% 左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。
（4）用户没有能够正确理解引物 OD 数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将 OD 读数，正确地转换成母液中 OD 数。这种情况比较常见。
（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
例如，验证标 2OD 引物量是否准确，简单的做法是： 加入 1ml 水，彻底溶解混匀后，取 100ul, 加入 900ul 水，用光径为 1cm 的石英比色杯，波长 260nm, 此时光吸收的读数为 0.2 。
4.需要合成多少 OD 数？
答：根据实验目的确定。一般 PCR 扩增，2OD 引物，可以做 200-500 次 50ul 标准 PCR 反应。如果是做基因拼接或退火后做连接， 1 OD 就足够了。但是有些研究人员，就做几次 PCR ，但是却要 5-10 OD 。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高 OD 数。片段越长 , 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的 OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
5.如何检测引物的纯度？
答：实验室方便的作法是用 PAGE 方法。使用加有 7M 尿素的 16% 的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取 0.2-0.5OD 的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性 ( 95℃ ,2mins) 。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。 600V 电压进行电泳，一定时间后 ( 约 2-3 小时 ) ，剥胶，用荧光 TLC 板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用 EB 染色或银染方式染色。
6.如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50pmol/ul 。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物 OD 数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。 一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成 50pmol/ul ，加水的体积（微升）按下列方式计算：
V ( 微升 )= OD 数×33×20000÷引物的分子量 。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。（注意： 1 OD260= 33 ug/ml）
7.如何计算引物的 Tm 值？
答：引物设计软件都可以给出 Tm ，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为 25mer 以下的引物， T m 计算公式为： T m = 4℃ (G + C)+ 2℃ (A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， T m 计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中， Size = 引物长度。
Tm 的定义： Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.
8.如何溶解引物？
答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或 10mM Tris pH7.5 缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（ pH4-5 ） , 引物在这种条件下不稳定。
9.如何保存引物？
答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物 -20 度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的 OD 数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。
10.合成的引物 5 | 
